Immuknow在预防肝癌肝移植术后复发中的临床应用研究及补体系统在肝癌中的作用机制研究

【摘要】肝癌的转移与复发是肝癌手术或肝移植术后患者死亡的主要原因之一。因此,探索肝癌侵袭转移与复发的发生机制,发现肝癌早期诊断的生物学指标,寻求有效的抗肝癌转移与复发治疗措施,对改善肝癌患者的预后具有重要意义。研究依据：免疫系统作为先天的防御系统,与肿瘤的发生、发展、转移和复发密切相关。作为细胞免疫的CD4+T淋巴细胞,是肝移植术后的排异反应的主导者,同时它可以激活功能性杀伤细胞CD8+T淋巴细胞,对肝癌肝移植术后的复发转移有一定的抑制作用,因而可能是提示预后的生物学指标之一。肝再生是在肝组织缺失或肝损伤之后的一种适应性反应,与肝癌的复发、转移和预后密切相关,补体成分C3a和C5a为肝脏再生所必需。而在此过程中补体是以何种途径被激活,目前尚不清楚。作为肿瘤的免疫应急反应中诱导产生的蛋白,C5a在抵御肿瘤的同时,辅助肿瘤组建防御T细胞的分子防线,促进肿瘤生长。C5aR在肝脏再生实质细胞中表达,并且在肝损伤后的肝细胞再生修复过程中发挥重要作用,并参与了肿瘤细胞抗凋亡、新生血管生成等。目前肝癌仍是世界上肿瘤相关死亡的首因,主要是由于缺乏具有高度敏感性和特异性的早期诊断肝癌的生物学指标。已有动物研究表明在肝癌成瘤的早期,血浆中补体成分C3水平升高,提示其可以作为肝癌早期诊断的生物学指标之一。作为一种炎症相关性肿瘤,肝癌与补体系统的关联不容忽视。但迄今为止,它们对肝癌的影响尚未有明确报道。本实验首先探讨了用Immuknow免疫功能监测了解肝移植术后CD4+T淋巴细胞的ATP酶活性,及其对肝癌肝移植病人预后的影响；还系统研究了补体系统与肝癌发生、发展以及预后的相关性,试图寻找提示肝癌预后新的生物学指标,从而为肝癌的诊断、治疗及复发的防治提供新思路。第一部分免疫细胞功能监测评估肝移植术后免疫功能及预测肿瘤复发的临床应用研究目的：探讨免疫细胞功能监测在肝移植临床的应用价值。方法：选取2002年7月-2010年3月期间在我院接受肝移植的病人252例,其中男217例、女35例,平均年龄48.2±13.5岁(28-71岁),取得近1000个血液样本。同期检测健康志愿者111例,其中男67例、女44例,平均年龄41.0±13.5岁(21-65岁)。我们评估了60例肝细胞癌患者的ATP值和移植术后肿瘤复发之间的关系,并前瞻性分析了ATP值在92例肝癌肝移植患者术后预测肿瘤复发的价值。结果：对肝移植术后稳定、排异、及感染病人的免疫功能ATP值进行统计和比较,发现肝移植术后稳定、排异、及感染病人的免疫功能ATP值分别为286.6±143.9ng/ml.418.9±169.5ng/ml、145.2±87.0ng/ml;对肝移植术后稳定和排异组,肝移植术后稳定和感染组病人的免疫功能ATP值两两比较差异有统计学意义。肝癌移植术后感染或急性排异病人的ATP平均值明显不同于稳定状态的患者。肝癌肝移植术后复发的病人ATP平均值明显低于那些没有复发的患者(137.8±66.4vs.289±133.9ng/ml)；肝癌肝移植术后预测肿瘤复发的理想阈值是175ng/ml,较之免疫力降低组(ATP≤175ng/ml),相对高的免疫力组(ATP>175ng/ml)患者表现出更好的无瘤生存期。多因素回归分析显示,ATP值是肝癌肝移植术后复发的独立预测指标。结论：免疫细胞功能监测可作为评估肝移植术后病人免疫功能状况的有效手段之一,与免疫抑制剂药物浓度监测合并应用,可以更加准确地评估肝移植术后病人的免疫功能状态,及准确地指导肝移植术后免疫抑制剂的使用,并可以用来评估肝癌肝移植术后感染或排异的风险以及预测移植术后肿瘤复发的风险。第二部分补体受体C3aR/C5aR在肝癌细胞系中的表达及功能研究目的：研究C5a/C5aR,C3a/C3aR,C5a/C5L2在不同转移潜能的肝癌细胞株中的表达差异以及功能特性,初步阐明补体受体对肝癌生物学特性的影响。方法：荧光定量PCR、WesternBlot等方法检测C5a/C5aR,C3a/C3aR,C5a/C5L2在不同转移潜能肝癌细胞的表达情况；借助细胞生长抑制实验(MTT法),细胞增殖检测实验(Brdu法),细胞凋亡定量检测实验(AnnexinV-FITC法),细胞周期分布检测实验(PI法),细胞划痕实验,细胞迁移侵袭实验(transwell),同时通过C5a,C3a补体刺激试验及转染C5aR/C3aR表达质粒,以及C5aR,C3aR抑制剂实验及转染shRNA,观察肝癌细胞的相关生物学特性的变化。结果：实时定量PCR以及蛋白印迹实验显示C5aR,C3aR,C5L2在不同转移潜能的肝癌中的表达与细胞的转移能力成正相关。在肝癌细胞株中高转移潜能细胞HCCLM3和MHCC-97H的C5aR,C3aR,C5L2mRNA和蛋白表达水平明显高于低转移潜能细胞MHCC-97及HepG2。上调或下调C5aR,C3aR,C5L2表达后可促进或抑制肝癌细胞的生长及增殖能力、降低或诱导肿瘤细胞的凋亡、阻止细胞在G2/M期或呈现轻微的G1期阻止、使肝癌细胞的迁移和侵袭能力明显增加或减少。C5aR,C3aR,C5L2的过量表达与β-catenin,MMP2,MMP9,CyclinD1的表达和分泌呈正相关,与E-cadherin,p21的水平呈负相关,下调C5aR/C3aR表达后,变化则相反。体内实验表明下调C5aR后,裸鼠肝癌移植瘤生长较对照组缓慢。结论：C5aR,C3aF及C5L2在肝癌发生发展中可能有重要作用。肝癌细胞C5aR,C3aR,C5L2表达的上调或下调能促进或降低肝癌的生长、侵袭与转移能力。第三部分补体受体C3aR/C5aR表达与肝癌临床病理特征及相关性研究目的：研究C3aR.C5aR在肝细胞癌组织中的表达情况,探讨C3aR、C5aR与原肝细胞癌的关系及临床生物学意义。方法：应用荧光定量PCR,WesternBlot及免疫组化方法检测C3aR、C5aR在肝癌及相应癌旁组织中的表达。并通过组织芯片检测405例肝癌组织中C3aR、C5aR的表达,统计分析C3aR、C5aR与肝癌临床病理特征及预后的关系。结果：实时定量PCR显示C5aR及C3aR在肝癌中的表达明显高于相应癌旁中的表达,两者间差异明显(P<0.01)。WesternBlot结果同样显示肝癌组织C5aR及C3aR蛋白表达含量高于癌旁组织。免疫组织化学显示肝癌组织中的表达明显高于后者(p<0.05)。根据临床患者数据分析,C5aR蛋白的过表达与肝癌患者是否有乙肝病史(P<0.05)以及病理分型(p<0.01)等临床病理因素有明显关联。C3aR蛋白的过表达与肝癌患者的肿瘤直径大于5cm(p<0.05)、微血管侵犯(p<0.05)以及复发(p<0.01)等临床病理因素有明显关联。C5aR和C3aR表达阳性组的5年总体生存率及无病生存率明显低于阴性组p<0.05)。分层Kaplan-Meier分析显示在有乙肝病史、肝癌细胞的低分化组中肝癌组织中C5aR过表达患者OS和DFS均较低表达组差。同时,在肿瘤大小、可见微血管癌栓组中肝癌组织中C3aR过表达患者OS和DFS均较低表达组差。单因素分析表明：影响肝癌OS预后的因素有血清GGT>54U/L、肝癌细胞的低分化、肿瘤直径大于5cm、多发性肝癌、有微血管癌栓、TACE、C3aR阳性及C5aR阳性：而影响DFS的因素有GGT>54U/L、肝癌细胞的低分化、肿瘤直径大于5cm、多发性肝癌、有微血管癌栓、TACE,C3aR阳性及C5aR阳性。多因素分析表明GGT>54U/L、肝癌细胞的低分化、肿瘤直径大于5cm、TACE、C3aR阳性阳性表达是影响OS的独立预后因素；血清GGT>54U/L、肝癌细胞的低分化、肿瘤直径大于5cm、TACE、C3aR阳性及C5aR阳性表达等为DFS的独立预后因素。结论：肝癌组织C3aR、C5aR高表达与肝癌的侵袭、转移等恶性表型显著相关,与不良预后相关,是患者术后复发转移及生存的独立预测指标。
【作者】成剑文；
【导师】周俭；
【作者基本信息】复旦大学，外科学，2013，博士
【关键词】肝癌病人；Immuknow；肝移植；免疫功能；细胞调亡；多发性肝癌；生物学指标；肝癌早期诊断；转移潜能；肝细胞癌患者；

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